1 培养基和试剂
平板计数琼脂、75%乙醇、磷酸盐缓冲稀释液
2 操作程序
2.1 样品制备
2.1.1以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装，则用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。
2.1.2制备样品匀液
以无菌操作取25g样品，放入装有225ml稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1-2min，制成1：10的样品匀液。如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却。
2.2 稀释样品匀液
2.2.1用10ml灭菌吸管准确吸取1：10的样品匀液10ml，放入装有90ml稀释剂的150ml 稀释瓶中。迅速振摇，将样品混匀，制成1：100的样品匀液。振摇时，幅度为30cm，7s内振摇25次。从容器中吸取样品匀液和以后的稀释操作中，吸管尖不要碰着瓶口。吸入的液体应先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的刻度。
2.3 平板接种
2.3.1对于每个样品，选用合适的三个连续稀释度的样品液进行平板计数。
2.3.2分别用灭菌吸管吸取1ml样品液放入作了适宜标志的平皿内。每个稀释度的样品液用两个平皿。
2.3.3分别加12-15ml平板计数琼脂(约45℃左右)到平皿内。立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。同时将平板计数琼脂倾入加有1ml稀释剂的另一灭菌平皿作空白对照。将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基，每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。
2.4 培养
待琼脂凝固后将平皿翻转，立即放进36±1℃的恒温培养箱培养48±2h。培养箱应保持一定的湿度，经48h培养的琼脂培养基的失重不得超过15%。
2.5 菌落计数和记录
2.5.1培养后，立即计数每个平板上的菌落数。25-250个菌落为合适范围。如不能立即计数，应将平板存放于0-4℃，但不得超过24h。
2.5.2操作者对同一平板复核自己的计数结果，其差异应在5%之内，而其他人对这一平板重复计数，其差异应在10%这内。否则，应找出原因，加以校正。
2.6 计算和记录数字：适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释度倍数计算出每克(毫升)样品中平板菌落数。
记录时，只有在换算到每克(毫升)样品中平板菌落数时，才能定下两位有效数字，第三位数字采用四舍五入的方法记录。也可将样品的平板菌落数记录为10的指数形式。
3 结果报告
报告每克(毫升)样品中平板菌落数或估计的平板菌落数。
9.保存细菌的方法
1、细菌保存于穿刺培养物中：一般细菌保存于穿刺培养物可以维持两年。具体方法：用灭菌接种针挑取分散良好的单菌落，针缓慢穿过琼脂到达瓶底，连续几次，盖上瓶盖拧紧，做好标记。室温下存放于暗处。(最好一点可以将瓶盖放松，在适当温度下培养过夜，再拧紧瓶盖并加封Parafilm膜，室温或最好在4度避光保存)。
2、细菌保存于含有甘油的培养物中：
(1)在液体培养基中生长的细菌培养物：取0.85ml细菌培养物，加入0.15ml高压灭菌甘油，振荡培养物使甘油分布均匀，然后转移到标记好的保存管内，密封，在乙醇-干冰或液氮中冻结后再转至-70度长期保存。在复苏时，用灭菌接种针刮取冻结的培养物表面，然后立即把黏附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平板表面，于37度过夜。
(2)在琼脂平板上生长的细菌培养物：从琼脂平板表面刮下细菌放入装有2mlLB的无菌试管内，再加入等量的含有30%灭菌甘油的LB培养基，振荡使甘油完全分布均匀后，分装于无菌保存管内，密封，再按前述方法冰冻保存。这一方法的优点在于可用于保存在质粒载体上建立的cDNA文库。
如果甘油与培养基混合后冻存在一般冰箱的冰冻室里，不能反复复苏使用，而且如果甘油含量太低，冻结成冰块，复苏效果不佳。一般都使用甘油终浓度为30%。
